18 Ekim 2015 Pazar

Primerler için TM Değeri Hesaplama

Primer tasarımı korkunç ve karmaşık gibi görünse de aslında dikkat edilmesi gereken noktalar bilindiğinde oldukça kolaylaşıyor. Hatta artık bu işi bizim yerimize yapabilecek bir çok araç biyoinformatik araç bulunmaktadır. Tabi ki tasarımın arkasında yatan mekanizmayı anlamadan bu araçları kullanmaya kalkmanın sonucu büyük ihtimalle bir hüsran olacaktır. Bu yazımda ben primer tasarımından bahsetmeyeceğim. Onun yerine primer tasarımında önemli faktörlerden biri olan TM sıcaklığının hesaplanmasından bahsedeceğim. Primer tasarımı konusunda bir şeyler öğrenmek istiyorsanız sizi böyle alalım. TM sıcaklığı hala ilginizi çekiyorsa aşağıdan devam edebilirsiniz.

Primerler tasarlarken amacımız bu primerin DNA üzerinde bir hedefe bağlanmasıdır. Bu bağlanmayı etkileyen bir çok faktör (şimdilik bunlardan bahsetmeyeceğim) bulunmaktadır. Bunlardan bir tanesi de TM değeridir. Temperature of melting'in kısaltılmış hali olan TM değeri tasarlanan primerin DNA'ya bağlanacağı spesifik sıcaklığı belirtmektedir. PCR sırasında bütün işlemler sıcaklığa bağlı olarak gerçekleşmektedir ve primerin doğru noktaya bağlanıp bağlanmaması da bu işlem sırasındaki sıcaklığa bağlıdır. 20 bazlık bir primeri düşünecek olursak aslında bu primer 19 bazının uyuştuğu bölgeye de oturabilir. Bu durumda istediğiniz ürünün dışında başka ürünleri de istemeden çoğaltabilirsiniz hatta çoğalan bölgeler içinde sizin istediğiniz bölge olmayabilir. TM sıcaklığı aslında primerin istenilen bölgeye spesifik olarak oturacağı sıcaklığı belirtmektedir. Eğer bu sıcaklıktan uzaklaşılırsa o zaman primer spesifik olmayan bölgelere oturabilir. Bu da spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına neden olur.

Peki bu TM değeri nasıl hesaplanır. Yazıyı yazmaya başlamadan önce internette hızlı bir tarama yaptım. TM hesaplamak için bir kaç formul bulunmakta. Bunların hepsi ayrı ayrı kabul görüyor. En sık karşılaştığım formül:

Tm (°C) = (4 x G+C) + (2 x A+T)

Bu formül ile sık karşılaşmamın sebebi sanırım oldukça basit olması. Tabi ki basit olması ve çok bulunması doğru olduğunu göstermez. Bu formül genel olarak kabul edilen formüllerden biri olsa da 13 bazdan uzun primer dizileri için kullanışlı değildir. Hesaplama sonucunda elde edilen değer size kesin bir TM değeri sunmaz fakat tahmini bir sonuç elde etmek için pratik bir yöntem olarak kullanılabilir. Sizin primerinizin TM değeri bulduğunuz sonucun 5 °C aşağısı yada yukarısı aralığında bir TM değeri olabilir.

Diğer karşılaştığım formül ise şu şekilde:

Tm (°C) = 64.9 +41 x (G+C-16.4) / (A+T+G+C)

İlk formülün 13 bazdan kısa olan primerlerin TM hesaplanmasında kullanıldığını söylemiştim bu formül ise 13 bazdan uzun bölgeler için TM değeri hesaplanılmasında kullanılmaktadır. Her ne kadar TM değerine yakın sonuçlar veriyor olsa da bunun da kesin sonuç verdiğini söylemek yanlış olacaktır. TM değerindeki 1 °C'lik farkın spesifik bağlanma üzerindeki etkisini düşünürsek bu formülü kullanarak zaman harcamak yerine biraz karmaşık olan fakat daha doğru sonuçlar bulmamızı sağlayacak olan aşağıda anlattığım yöntemi kullanmak daha iyi olacaktır.

Aslında TM değerini etkileyen tek faktör primerin içerdiği bazların sayısı değildir. TM değerini etkileyen bir diğer faktör ise primerin içerdiği bazların sıralamasıdır. Yan yana gelen bazlar değiştikçe bunların bağlanması için gerekli olan enerji miktarı değişiyor ve bu da aslında karmaşık bir şekilde TM değerinin hesaplanmasını sağlıyor. Bu karmaşık formüllere girip kimsenin aklını karıştırmayı istemem. Hesaplanması için kısa bir yol göstereceğim. Ama yok ben arkada olan biteni bilmek istiyorum diyorsanız sizi böyle alabiliriz. Aslında TM değerini etkileyen bir şeyler daha var. Onlarda ortamda bulunan dNTP, magnezyum ve sodyum miktarları. Bunların miktarının değişmesi  TM değerini doğrudan değiştiriyor. Yukarıdaki formüllerin neden sonuçları kesin olarak vermediği eminim şuan anlaşılmıştır. Peki bu kadar değişken ile nasıl TM hesaplayacağız. Formül de oldukça karışık demiştik. İşte bu gibi durumlarda biyoinformatik yardımınıza yetişiyor. Programlama bilmiyor olabilirsiniz biyoinformatik de bilmiyor olabilirsiniz bunların hiç birine gerek yok. Saolsunlar bizler için bunu hesaplayacak yazılımları geliştirmişler. Bunlardan benim en sevdiğim ve güvendiğim ise IDT'nin web aracı. Bu aracı kullanarak istediğiniz primerin TM değerini belirleyebilirsiniz. Kullandığınız primerlerin TM değerinden emin değilseniz bir de bu aracı kullanarak kontrol etmenizi öneririm. 

Programlama bilenler için aslında bunu yapan bir çok kütüphane bulunmakta. Eğer merak ediyorsanız Python için Primer3 bunlardan sadece birisi. Belki ileride bundan daha detaylı bir şekilde bahsedebilirim. Başka bir yazıda yeniden görüşmek dileğiyle.


Hiç yorum yok:

Yorum Gönderme